导读

• 蛋白质从头测序是什么？

• 蛋白质从头测序分析流程是什么？

• 蛋白质从头测序数据分析的理论基础是什么？

一、蛋白质从头测序的原理

简单来说蛋白质从头测序就是不依赖于任何现有的DNA或者蛋白质的数据库信息，直接对蛋白质氨基酸序列进行测定。蛋白质从头测序的原理是基于蛋白酶切后的肽段分子在质谱检测中有规律性的断裂，找到特定断裂模式，再根据质谱峰之间质量差即可算出对应的氨基酸信息，以及氨基酸上的翻译后修饰。

蛋白质从头测序的优势特点

蛋白质从头测序法的一大特点就是可以不借助任何蛋白质或者DNA数据库信息，直接对蛋白质的序列进行分析。相比传统的质谱数据库搜索法有着不可比拟的优势，那就是从头测序法可以应用于分析新物种的蛋白质序列，以及基因组未被测序的物种的蛋白质序列。

二、蛋白质从头测序的分析流程

图1. 蛋白质从头测序的分析流程图

蛋白质从头测序的分析流程

• 使用蛋白酶对分离纯化后的待测蛋白质样品进行酶切，将蛋白质剪切成一定大小的多肽片段。（可以分别选用多种蛋白酶进行酶切，以确保蛋白质的全序列可以被鉴定分析到）
• 使用高效液相色谱对肽段酶切产物进行分离纯化，这样有利于接下来更为高效准确的质谱分析。
• 被分离的肽段再经由质谱分析前首先经过软电离处理使肽段带上一定量的电荷，接着飞行进入质谱仪。首先经过一级质谱对肽段离子进行筛选。
• 经过一级质谱筛选后的肽段分子，再进入碰撞室，与室内的碰撞气体（常用的碰撞气体通常有He，Ar，Xe，CH4等惰性气体）进行碰撞诱导肽段共价键断裂，产生子离子，再经由二级质谱（MS2）分析肽段序列。
• 借助特定软件对各个肽段的二级质谱峰进行从头序列分析，再对肽段序列拼接获得蛋白质全长序列。

上面我们讲到了蛋白质从头测序的分析流程，熟悉质谱鉴定的同学能够发现，蛋白质从头测序的实验流程与常见的串联质谱分析大同小异，那么大家看到这可能想要问了，那么蛋白质从头测序法究竟是如何实现直接对蛋白质的序列进行分析的呢？其实，从头测序分析的核心就在于对二级质谱峰的数据分析上面。那么接下来，小编就给大家详细地介绍从头测序数据分析的基础原理。

三、蛋白质从头测序数据分析原理

小编在文章前面介绍蛋白从头测序的原理时，也提到过蛋白质从头测序分析的理论基础是基于肽段在二级质谱诱导碎裂时是有规律地断裂的。根据肽段断裂的位置，可以产生不同种类的离子，在靠近N端的地方断裂产生的离子有a，b，c三种类型的离子，在靠近C端的地方断裂产生的离子有x，y，z三种类型。以N端断裂离子为例，其中a型离子由第一个氨基酸C=O前面的C-C键断裂产生的N端离子，b型离子是由第一个氨基酸和第二个氨基酸之间的C-N键断裂产生N端离子，c型离子是由第二个氨基酸的N-C键断裂形成的（如图2所示）。对于N端端裂的离子来说，断裂的位置不同产生多种不同的a，b，c型离子，为了进一步对在不同的断裂点产生的同一类型的离子进行区分，每个离子下方都标记了罗马数字指代断裂的位置。（如图2，a1，a3指代断裂位置不同的同一类a型离子）

图2. 肽段断裂产生的子离子类型

介绍完肽段碎裂的规律后，我们可以发现每个肽段碎裂产生的离子都有各自的特点，其中b型离子较为特殊，因为b型离子断键的位置位于两个氨基酸残基之间，因此每两个相邻的b离子的质量差等于NH2C2O-R（如图3所示）。不同的氨基酸的R基质量是不同的，因此，如果能够在二级质谱的众多质谱峰中确定b离子的峰图，根据出两个相邻的b型离子的质量差，就可计算出R基的质量大小，然后根据R基即可确定对应的氨基酸。除此之外，如果氨基酸残基上有翻译后修饰，也可以使用b型离子间的质量差来计算翻译后修饰的质量，从而推算可能的翻译后修饰。

图3. b型离子断裂模式

由于经过一次碎裂碰撞，大多数肽段只会有一处断裂，因此，只要在二级谱图中找到b型离子的分布图谱，那么每两个b型离子的质量差就是氨基酸的质量，我们可以使用这一信息找到质量匹配的氨基酸。

但是从二级谱图中众多的离子峰来确定b型离子的质谱峰，涉及到复杂的建模以及概率推算，因此，依靠人工的方法选择b型离子的峰图是不现实的，目前有许多从头测序分析的软件可以帮助我们完成这一步骤，例如， PEAKS和NovoHMM等。不同的软件对b型离子图谱推算原理各有不同，但都是推测的数据需要与实际测得的图谱进行多次比对，才能实现对序列的精准无误的分析。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

>>点击了解更多优质服务项目